天正十年 (1582 年) 三月，武田家敗亡。與此同時，信長控制以京都為中心的近畿全境，剩下的大敵只有：中國地區的毛利氏、關東地區的北條氏、北陸地區的上杉氏。
羽柴秀吉奉命攻打毛利氏的鳥取城，瀧川一益、德川家康開展對北條氏的征伐，至於上杉氏，主要由柴田勝家負責對付。
另外，信長派出丹羽長秀和三子織田信孝準備渡海平定四國的長宗我部氏，九州島津氏、大友氏和東北的大名也紛紛表示臣服。戰國時代彷彿會在信長手中畫上句號。
五月十五至十七日，織田信長召德川家康到安土城晉見，明智光秀負責接待。羽柴秀吉向信長求援，信長解除光秀接待職務，命其馬上返回自己的封國，準備出兵救援秀吉。
信長未幾率領百餘名年輕侍衛從安土城出發，進駐京都本能寺，計劃在此集結軍隊，支援秀吉，嫡子織田信忠則駐紮在妙覺寺。
據信長家臣太田牛一所撰《信長公記》，本能寺四周有防衛壕溝，內側構築防禦工事，修建柵門以警戒進出，換言之，信長是住在一座有軍事防禦功能的寺廟內。
六月一日，信長在本能寺舉行茶會。當天下午，光秀率領一萬三千多名士兵從丹波龜山城出發，號稱「接受信長公的檢閱」，向京都移動。六月二日凌晨，橫渡桂川時，明智光秀突然發動軍事政變，討伐位於本能寺的信長。《明智軍記》記有光秀向全軍大喊「敵人在本能寺！」(「敵は本能寺にあり！」)，這可視為「本能寺之變」的標誌。
信長聽到兵器聲響，初時以為是衛兵武士醉酒吵鬧，及後知悉光秀叛變，頗覺無奈。據傳教士路易斯・弗洛伊斯記載，信長曾親自以弓箭射殺明智士兵，並指揮森蘭丸持槍拒敵，可惜最後被明智軍用弓箭射中，負傷退入殿內。侍衛忙喚信長逃脫，信長見明智軍人多勢眾，心知形勢不妙，不願離去，決定切腹自盡。
《信長公記》指混戰時寺內發生火災，而本能寺地下本儲存有大量火藥 (本能寺僧侶在赴種子島傳教時接觸了來自歐洲的鐵炮，之後成為日本戰國時代鐵炮推廣的重心之一，故設有存放火藥的倉庫)，信長的遺體卒之被熊熊烈火燒得灰飛煙滅。
信長嫡子織田信忠得知光秀叛變，和當時京都的行政長官村井貞勝逃離妙覺寺，前往誠仁親王居住的二條御所。光秀率兵猛攻，信忠和五弟織田勝長因寡不敵眾，自殺身亡，年僅二十六歲。
信長和信忠的死去，對織田家構成致命打擊。信長統一日本的努力，在一夜之間化為烏有。尤其甚者，織田家內部出現繼承人紛爭。
光秀一度爭取女婿細川忠興加入討伐信長其他部將，未能成功。十三日後，光秀兵敗身死。
