永祿十二年 (1569 年) 一月，信長率主力部隊返回美濃，期間阿波國三好氏三名武將 (三好長逸、三好政康、岩成友通) 竟聯同齋藤龍興等襲擊足利義昭的臨時御所六條本圀寺。信長援軍趕至，擊退三好、齋藤聯軍。「本圀寺之變」後，信長按照原定計劃攻打伊勢國。只用了短短幾年時間，他便把伊勢國納入自己的控制範圍。
與此同時，足利義昭試圖重塑幕府的榮耀，這使得他與信長之間存在不可調和的矛盾，後者只把他當作傀儡。義昭與信長暗中較勁，信長為限制義昭的大將軍權力，訂立了稱為「殿中御掟」九條掟書 (公布法或公定法)，之後復追加七條昭告天下，並迫使義昭承認這項命令。義昭與信長的對立日益顯著。
信長繼而以義昭的名義對各地大名發佈要求上洛參見的命令，越前國朝倉義景對此反應冷淡。元龜元年 (1570 年) 4 月，信長夥同盟友德川家康向越前國進軍。
朝倉軍節節敗退，突然，織田信長妹夫近江國淺井長政基於父親淺井久政的要求，決定撕毀與信長的盟約，派出家臣出使越前國，向朝倉義景表示願意夾擊信長，以守護淺井與朝倉家長久的友好關係。淺井的背叛令織田、德川聯軍陷入危機，全賴木下藤吉郎、明智光秀、池田勝正等奮戰殿後，織田、德川聯軍方能夠順利撤退。
金崎之戰激起信長對淺井家的忿恨。同年六月，信長出兵攻打近江國。織田、德川聯軍與淺井、朝倉聯軍在姊川河原 (今滋賀縣長濱市野村町附近) 對峙。織田、德川聯軍率先發動攻擊，未有重大突破。淺井、朝倉聯軍精銳接連攻破木下藤吉郎、柴田勝家等大將的軍陣，最後卻遭織田、德川聯軍夾擊。隨著淺井、朝倉聯軍的右翼潰敗，姊川合戰勝負已分，淺井家受到重挫。
比叡山延曆寺一再包庇淺井、朝倉聯軍，元龜二年 (1571 年)，信長採取殘酷武力手段反擊，率軍焚燬寺院。
淺井長政與父親退守小谷城，天正元年 (1573 年)，小谷城之戰爆發，織田軍以壓倒性兵力攻佔小谷城，淺井久政 9 月 23 日在京極丸切腹自盡，三日後淺井長政在小谷城本丸切腹自盡，死前留下遺言囑託妻子阿市帶著三個女兒 (即茶茶、阿初、阿江) 回到織田家，並送她們出城。
武田信玄在北條氏康死後，與後繼者北條氏政修補關係，重新結盟。武田軍自甲府出發，兵分三路，向織田信長的盟友德川家康的軍隊發動攻擊，三方原之戰爆發。三方原之戰是武田信玄以上洛為目的的一場戰爭。武田軍最後取得勝利，往西前進，可惜中途武田信玄病情惡化，未幾病死。
